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多肽修飾: 生物素化

親和素與生物素之間非常穩定的、非共價作用在化學和生物學領域是 常運用的工具之一。生物素是復合維生素B2的組成部份。它與雞清蛋白、親和素、真菌蛋白、鏈霉親和素均有較高親和性和結合力。親和素和鏈霉親和素都是四聚體蛋白，可緊緊地結合四分子D-biotin，其結合力是已知自然界中 強的非共價作用（Kd = 10-15 M)。

生物素與親和素之間的相互作用可用于蛋白純化、檢測、固化、藥物導向、蛋白質結構分析等。

多肽和蛋白的相互作用

  檢測與某一多肽相互作用的物質， 簡單的方法就是利用此多肽做親和pull-down實驗，然后直接檢測結合蛋白。蛋白質體外結合(Pull-down)試驗可用于驗證蛋白-蛋白相互作用的存在（經由別的研究方法預測過的，如免疫共沉淀）和作為一種初級的篩選試驗來識別一些未知的蛋白-蛋白相互作用。通過競爭性阻斷結合，合成肽通常被用來驗證被假設的蛋白質-蛋白質相互作用。

生物素標記肽含有一個特殊的功能區和相當于參照的未修飾肽，此肽可被錨定在親和素共軛的磁珠上，將這些磁珠與目標樣本共同孵育（如核提取物或純化的重組蛋白），通過洗滌去除未結合的蛋白，然后洗脫結合的蛋白質， SDS/ PAGE分析，經蛋白染色即可直接觀察。通過比較分別與修飾和未修飾多肽相結合的蛋白質，即有可能確定候選者，即特定功能蛋白的“reader”蛋白。

帶有一些特殊修飾的生物素標記肽可以通過化學合成，純度達80％以上。肽長度應該在15-20個氨基酸。目標修飾位于序列中間時，兩翼氨基酸殘基不能少于6-8個。一般情況下，生物素多被偶聯在N末端或C末端。如果無特殊要求，我們建議生物素偶聯至N-末端，其優勢是修飾的成功率更高，生產的時間更短，并且易于操作。此外，如果偶聯至C-末端，需要額外增加一個賴氨酸。

生物素標記肽的Pull-down實驗方案

  生物素標記肽可與親和素磁珠共軛以生成樹脂，用于肽pulldown試驗。先把生物素標記肽上樣至Immobilized streptavidin beads (Pierce) 錨定有親和素的磁珠上，再與細胞裂解液孵育。細胞裂解于1％（v/v）Nonidet P-40, 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, protease inhibitors (Complete Tablets, Roche Applied Science), 加入 1 mM sodium orthovanadate作為磷酸酶抑制劑。等量的蛋白質分別與被錨定的多肽在4℃孵育6小時。經過大量洗滌，在SDS樣品buffer中煮沸，結合蛋白可從被錨定的多肽洗脫下來，或者，用50 mM dithiothreitol將多肽與蛋白復合物從磁珠中斷開。將來自活性肽和對照目標肽pull-downs的洗脫液合并，以作進一步的分析。

  上圖為鏈霉親和素-生物素鍵力測量示意圖。由于它們異常高的親和結合性，其中 突出的配體-受體對是鏈霉親和素-生物素（streptavidin-biotin）和親和素-生物素（avidin-biotin）。 這兩種蛋白質都有一個四聚體的結構，這樣他們可以結合4個配體。

知識背景介紹

  L ifeTein可為您的蛋白與蛋白相互作用研究提供生物素標記肽合成服務。通常，生物素可被標記在N端或C端(經由Lys)。我們推薦N端標記，其標記的成功率更高，所需時間更短，操作更簡潔。多肽都是由C端向N端合成。在SPPS合成草案中，N端修飾是其 后一步，不再需要其他特別連接步驟。相反，C端修飾不僅需要額外的步驟，而且過程更復雜。但是，理論上，生物素化可被定位在任何位置。

生物素可通過各種不同的linker或spacers與多肽隔離。一般建議引入間隔器如Ahx（一個6碳鏈接器)讓生物素更穩定或更靈活。

·源肽生物提供N端或C端生物素標記：Biotin (N terminus), Lys(Biotin)(middle), Lys(Biotin)(C terminus)。

·帶有linker(Ahx)的生物素化: Biotin-Ahx (N terminus), Lys(Ahx-Biotin)(middle), Lys(Ahx-Biotin)(C terminus)。

蛋白研究領域的應用

  在許多蛋白研究領域中，生物素標記肽通常與親和素結合而被檢測或純化：: 免疫印跡（WB）、ELISA、免疫沉淀 (IP)、,多肽親和純化、免疫組化 (IHC)、細胞表面標記、流式細胞術/熒光激活細胞分類(FACS)。

  ·鎖定蛋白或其他蛋白復合物，使用生物素化多肽作為誘餌可從某樣品中捕獲某一假定的結合成份。其中一個策略就是使用鏈霉親和素一步法捕獲體內生物素化蛋白和串聯親和純化，即傳統親和標簽（FLAG或6HIS）外加一個生物素多肽。

· 首先將生物素標記肽固化在親和支撐材料上，例如親和瓊脂糖。

· 與固相載體一起孵化天然樣品。

· 洗掉固相載體中未結合的樣品成份。

· 通過改變緩沖液條件來洗脫目的分子及其關聯蛋白。

· 生物素-親和素的親和力越高，對洗脫條件的要求越嚴。這一特點將有效減少其他親和標簽或天然抗體的背景結合。所以它很方便地用來確定兩個純化蛋白質在各種緩沖液中的相互影響（結合）能力。

僅有很少的天然生物素蛋白。所以交叉反應的機率非常低。生物素酰化從而可以用來從細胞裂解液中獲得蛋白質相互作用信息