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二硫鍵廣泛存在與蛋白結構中，對穩定蛋白結構具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基，經氧化形成。形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程， 可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應進程進行監測。
如果多肽中只含有1對Cys，那二硫鍵的形成是簡單的。多肽經固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中進行氧化。
當需要形成2對或2對以上的二硫鍵時，合成過程則相對復雜。盡管二硫鍵的形成通常是在合成方案的最后階段完成，但有時引入預先形成的二硫化物是有利于連合或延長肽鏈的。通常采用的巰基保護基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團。我們分別列出兩種以2-Cl樹脂和Rink樹脂為載體合成的多肽上多對二硫鍵形成路線：
二硫鍵反應條件選擇
二硫鍵即為蛋白質或多肽分子中兩個不同位點Cys的巰基（-SH）被氧化形成的S-S共價鍵。 一條肽鏈上不同位置的氨基酸之間形成的二硫鍵，可以將肽鏈折疊成特定的空間結構。多肽分 子通常分子量較大，空間結構復雜，結構中形成二硫鍵時要求兩個半胱氨酸在空間距離上接近。 此外，多肽結構中還原態的巰基化學性質活潑，容易發生其他的副反應，而且肽鏈上其他側鏈 也可能會發生一系列修飾，因此，肽鏈進行修飾所選取的氧化劑和氧化條件是反應的關鍵因素， 反應機理也比較復雜，既可能是自由基反應，也可能是離子反應。
反應條件有多種選擇，比如空氣氧化，DMSO氧化等溫和的氧化過程，也可以采用H2O2，I2， 汞鹽等激烈的反應條件。
空氣氧化法：
空氣氧化法形成二硫鍵是多肽合成中最經典的方法，通常是將巰基處于還原態的多肽溶于水中，在近中性或弱堿性條件下（PH值6.5-10），反應24小時以上。為了降低分子之間二硫鍵形成的可能，該方法通常需要在低濃度條件下進行。
碘氧化法：
將多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘進行氧化，反應15-40min。當肽鏈中含有對碘比較敏感的Tyr、Trp、Met和His的殘基時，氧化條件要控制的更精確，氧化完后，立即加入維生素C或硫代硫酸鈉除去過量的碘。
二對及多對二硫鍵成環策略
當序列中有兩對或多對二硫鍵需要成環時，通常有兩種情況：
自然隨機成環:
序列中的Cys之間隨機成環，與一對二硫鍵成環條件相似；
定點成環：
定點成環即序列中的Cys按照設計要求形成二硫鍵，反應過程相對復雜。在 固相合成多肽之前，需要提前設計幾對二硫鍵形成的順序和方法路線，選擇不同的側鏈 巰基保護基，利用其性質差異，分步氧化形成兩對或多對二硫鍵。
通常采用的巰基保護 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團。
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